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虫草活力素对大鼠慢性支气管哮喘模型气道重塑作用初探
张 旻1 周 新1 唐 亮2 余伯成2 李 群1 张杏怡1 张国清1
(1. 上海交通大学附属第一人民医院呼吸科，上海200080；
2. 上海国宝企业发展中心，上海200001)
【摘要】 目的 对虫草活力素(简称虫草) 在大鼠支气管哮喘(简称哮喘) 模型气道重塑中的作用及相关机制进行初步探讨。 方法 50只Wister大鼠[6~8周龄， (200±20) g]，随机数字表法分为阴性对照组(A)、慢性哮喘单纯模型组(B)(卵清白蛋白系统致敏和反复激发) 、慢性哮喘+虫草50 mg/kg 治疗8周组(C)、慢性哮喘+ 布地奈德(BUD) 8 周治疗组(D)及慢性哮喘+BUD联合虫草8周治疗组(E)。肺组织切片HE染色观察病理变化并检测气道管壁厚度，采用免疫组织化学法检测气道转化生长因β1(TGF-β1)表达水平，应用逆转录PCR 法检测肺组织A2a腺苷受体(A2aAR)mRNA 表达。数据统计采用ANOVA检验进行组间分析, Mann-Whitney 检验进行组内两两比较, Spearman 等级相关分析。 结果 ①HE染色显示所有药物干预组较单纯模型组炎症细胞浸润、平滑肌肥厚及黏膜肺组织水肿等炎症表现明显减轻，以D和E组最为明显；②5组气道管壁厚度依次分别为( 9.89±2.09) 、( 21.72±3.16) 、( 14. 94±1.96) 、 ( 12.29±2.75)和( 12.25±2.32) μm2/μm， F = 31.37， P <0.0001，所有药物干预组气道壁厚度均高于对照组(C组、D组和E组与A组比较后的P值分别为0.0001、0.0524、0.0524) ， 且低于单纯模型组(C组、D组和E组与B组比较后的P值均< 0.0001)，差异有统计学意义， C 组气道壁较D组和E组增厚， 差异有统计学意义(P值分别为0.0232和0.0147)；③5组TGF-β1表达强阳性率分别为(2.08±1. 63) %、(29.37±5. 08) %、( 12.30±3.26) %、(10.78±3. 35) %及( 7.43±2. 84) %，F =86. 45，P < 0.0001，所有药物干预组 TGF-β1蛋白表达均高于对照组(C组、D组和E组与A 组比较后的P值均<0.0001)，且低于单纯模型组(C组、D组和E组与B组比较后的P值均< 0.0001)，差异有统计学意义；E组较C组的蛋白表达有统计学意义下降( P = 0.005 2) ； ④5组肺组织 A2aAR mRNA 表达相对强度依次为( 0.35±0.06) 、( 0.27±0. 10)、( 0.52±0. 07) 、( 0.24±0.05) 及( 0.47±0.08) ， F =26.46， P< 0.0001，C组和E组A2aAR mRNA 表达高于A组( P值分别为0.0001及0.0007)、B组( P值分别为0.0002及0.0003) 和D组(P值均< 0.0001)，差异有统计学意义，D组表达低于A组，差异有统计学意义( P = 0.0003)；⑤所有大鼠支气管壁厚度与气道 TGF-β1蛋白表达存在正相关( r = 0.80，P <0.01)，而C组大鼠肺组织 A2aAR mRNA 表达和 TGF-β1蛋白表达呈负相关( r =－0.68，P = 0.03)。结论 虫草对哮喘模型的气道重塑具有一定的改善作用，其机制可能通过增加慢性哮喘模型大鼠肺组织 A2aAR mRNA 转录，抑制气道 TGF-β1的生成，从而减轻气道重塑，且虫草与糖皮质激素联合应用对于降低 TGF-β1的表达具有潜在协同作用。
支气管哮喘(简称哮喘)作为一种常见呼吸系统慢性疾病, 其发病率在世界范围内持续上升。哮喘主要表现为气道高反应与变异性较大的可逆性气流阻塞, 目前认为上述改变的主要成因在于气道的持续性损伤和结构异常, 即谓气道重塑, 而转化生长因子β1(TGF-β1) 是迄今发现在气道重塑最强的促气道纤维化因子。
虫草活力素(简称虫草) 为北冬虫夏草的主要活性成分, 目前大量药理学研究表明其具有耐缺氧、 抗炎、调节免疫功能及抗肝纤维化等作用, 其作用靶点可能在于腺苷受体( AR)。本研究旨在通过观察大鼠气道中TGF-β1的表达以及气道中 ARmRNA 的转录变化, 对虫草在慢性哮喘气道重塑中的干预作用及靶位进行初步探索。
哮喘的气道重塑是由多种细胞、炎症介质、生长因子参与下出现的不完全修复, 由于尚无重塑过程完全依赖于慢性炎症的令人信服的证据, 因此有学者认为气道重塑可能与气道炎症并行, 并导致慢性炎症的发生和持续。气道重塑主要表现为气道壁增厚、细胞外基质(ECM) 沉积、气道血管生成/ 血管重塑、气道平滑肌增生、肥大及黏液腺增生和黏液性化生。虽然哮喘重塑与间质性肺疾病所致肺纤维化的典型病理特征相似, 但由于哮喘气道慢性炎症主要为嗜酸粒细胞(EOS) 浸润, 巨噬细胞与其他细胞增加很少或不增加, 因此又有其特殊性。其调控因素众多, 包括生长因子、T辅助细胞(Th) 1/ Th2 细胞因子失衡、 基质金属蛋白酶、 内皮素、 前炎症细胞因子以及趋化因子等。
众多研究显示在生长因子中, TGF-β1可能是哮喘气道重塑的主要调控因子, 而其亚型 T GF-β1是成纤维细胞的化学诱导剂, 通过自分泌、 血小板衍生生长因子途径对成纤维细胞的增殖发挥双峰效应, 同时也是成纤维细胞胶原最有效的刺激剂。因此本研究以 TGF-β1作为观测指标, 结果显示其表达水平与气道管壁厚度呈正相关, 再次印证了上述观点。由于当前吸入性糖皮质激素仍是预防气道重塑的首选治疗, 故本研究以BUD作为阳性对照药物, 同时增加联合治疗组, 以观察其是否存在协同作用。结果发现单独使用虫草治疗较单纯哮喘模型支气管壁厚度显著下降, 但仍差于糖皮质激素治疗组, 而糖皮质激素单独用药和联合虫草对于支气管壁厚度改善无差异, 提示虫草虽可在一定程度改善气道重塑, 但是较糖皮质激素而言仍有差异。而对于TGF-β1在肺组织的表达结果则显示虫草和糖皮质激素无治疗差异, 且联合用药具有显著的协同作用, 提示虫草对于 TGF-β1 具有良好的抑制作用, 而糖皮质激素可能同时存在 TGF-β1以外的作用途径改善气道重塑。
有研究表明, 虫草可通过调节肺灌洗液中的细胞含量, 降低蛋白酶活性而对于由内毒素引起的小鼠急性肺损伤具有保护作用, 并可通过对大鼠肺气肿模型 Th1/ Th2 相关细胞因子平衡的纠偏作用改善气道慢性炎症, 但虫草在哮喘动物模型气道重塑中的作用目前国内外尚缺乏系统性研究的报道。
虫草的主要药效成分为虫草素, 即 3’-脱氧腺苷, Linden研究发现胞外腺苷聚集是炎症反应初始阶段限制细胞损伤的机体防御性反应, 是保护性的自分泌和旁分泌的信号转导机制。腺苷和其他内源性物质在炎症反应中适度激活抑制性信号传导系统, 其重要性在多种炎症疾病中都已被证明( 如败血症、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化和肿瘤等)。腺苷在炎症反应中的调节作用是通过 AR 介导, AR 属 G-蛋白耦联受体超家族, 目前已发现4种亚型, 分别是 A1AR、 A2aAR、A2bAR 和A3AR[11], 其在支气管肺组织中均有分布, 研究表明抗原吸入可降低哮喘患者痰液和血清中AR的表达。而其中A2aAR 活化可抑制多种炎性细胞的聚集和炎症介质的释放已在多项研究中证实, 故本研究以 A2aAR 作为虫草的推测作用靶点进行研究, 结果发现哮喘模型组 A2aAR mRNA 的含量较正常对照组降低亦证实了上述观点。本研究显示虫草可增加 A2aAR mRNA 转录水平, 且在虫草组 TGF-β1和 A2aAR mRNA 含量呈负相关, 提示虫草可能通过A2aAR 的表达增加抑制TGF-β1的生成, 从而减轻气道重塑。而A2aAR 和TGF-β1的表达在其他各组无相关性存在, 是否预示低于或等于生理状态的 A2aAR 表达水平未参与TGF-β1表达有待于进一步研究。而且值得注意的是, 糖皮质激素组 A2aAR 表达与哮喘模型组无差异, 且反较正常组降低, 提示糖皮质激素对于哮喘气道重塑可能未经过A2aAR 途径。结合对于气管壁厚度的作用在糖皮质激素和联合治疗无异, 预示A2aAR 途径在哮喘的气道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 这也可能可解释为什么联合治疗对TGF-β1表达具有协同作用。同时上述结果对糖皮质激素依赖型哮喘的治疗探索亦具有潜在的提示意义。
总之, 本实验表明虫草可能通过增加慢性哮喘肺组织 A2aAR mRNA 转录, 抑制气道T GF-β1的生成,从而减轻气道重塑。由于 A2aAR 的升高在哮喘气道重塑中可能具有一定但非最主要的作用, 因此虫草单独使用对于气道重塑的改善作用较糖皮质激素有限, 但是联合用药对于对于降低 TGF-β1的表达具有潜在的协同作用。
（摘自：《国际呼吸杂志》2011年第31卷第9期：78-83）
