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虫草素对小鼠慢性哮喘模型支气管平滑肌收缩的作用及机制研究
张旻1 周新1 唐亮2 余伯成2 李锋1 张杏怡1
（1. 上海交通大学附属第一人民医院呼吸科，上海200080；
2. 上海国宝企业发展中心，上海200001）
【摘要】 目的 评价虫草素及虫草素与糖皮质激素联合应用对慢性哮喘模型小鼠气道平滑肌收缩的调节作用及可能机制。方法 将32只C57／BI6小鼠随机分成对照组和慢性哮喘模型组，利用肌动描记仪比较p38蛋白激酶抑制剂SB239063(10-6 M)、虫草素(10-6M)以及糖皮质激素地塞米松(10-6 M)单独或联合孵育前、后由乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)诱导的支气管收缩反应，同时应用蛋白印迹检测支气管组织中p38蛋白激酶和热休克蛋白 27(heat shock proteins 27，HSP27)的磷酸化状态。结果 模型组小鼠的支气管收缩较对照组加重，有统计学意义。对照组和模型组p38蛋白激酶抑制剂SB239063孵育1 h后对Ach介导的收缩反应较空白对照组下降(P<0.05)，地塞米松单独和地塞米松联合虫草素在模型组小鼠Ach诱导支气管平滑肌收缩力的作用均较对照组降低(P<0.05)；地塞米松单独和地塞米松联合虫草素孵育后，对照组和模型组小鼠支气管组织p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平较Ach单纯作用组降低，而且在模型组，使用虫草素干预后p38蛋白激酶和HSP27磷酸化水平较Ach单纯作用组下降(P值均<0.05)。结论 Ach诱导的离体支气管收缩反应具有良好的可重复性，卵清白蛋白吸入可导致Ach诱导的支气管收缩反应加重。糖皮质激素联合虫草素治疗较糖皮质激素单独治疗更有效抑制Ach诱导的气道平滑肌收缩，此种潜在的协同作用可能通过更大程度地抑制p38蛋白激酶信号通路为机制。
支气管哮喘(简称哮喘)是一种常见呼吸系统慢性疾病，发病率在世界范围内持续上升，未来15～20年内，全球哮喘患者将由目前的3亿升至4亿，并由此引发严重的疾病相关经济负担。气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)是指气道的过度收缩，表现为气道对一系列药理、化学、生理性吸入刺激物(包括胆碱类、组胺、腺苷单磷酸、二氧化硫、冷空气等)产生的过渡收缩反应。作为哮喘进展的危险因素，AHR与疾病的严重程度、肺功能降低程度相关，为评价药物疗效的重要终点指标之一。故深入研究气道平滑肌的收缩机制对于认识、防治气道平滑肌过度收缩即AHR有着重要意义。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)属于丝／苏氨酸激酶家族，包括三个主要的蛋白激酶途径，有研究表明其在乙酰胆碱(acetylcholine，Ach)诱导的收缩反应中受到活化。并启动其下游信号链参与气道平滑肌的收缩。
糖皮质激素(简称激素)是治疗哮喘有效的抗炎和预防药物，目前有关激素作用机制的研究多注重于抗炎作用，而抑制气道平滑肌收缩效应的研究报道较少。虫草素(3’-脱氧腺苷)是冬虫夏草的主要药理成分，我们既往研究表明其对于慢性哮喘的炎症和气道重塑有一定作用，而对于气道平滑肌的直接作用了解很少。本研究旨在应用肌动扫描技术检测不同浓度虫草素、激素以及两者联合应用对离体支气管收缩力的作用，以观察虫草素与激素对气道平滑肌收缩力的直接作用以及有无协同作用，并通过对Ach诱导离体支气管收缩后观察激素和(或)虫草素对于p38MAPK磷酸化水平的作用，探究上述信号通路在Ach诱导的平滑肌收缩的作用以及对于激素和(或)虫草素治疗的介导作用。
AHR是哮喘发生发展的重要危险因素之一，与疾病的严重程度、肺功能降低程度相关。过去AHR仅被视为气道炎症的表象，故对其研究只关注于炎症细胞、细胞因子、炎症介质和免疫应答，而作为气道收缩的效应器—气道平滑肌关注较少。近年研究发现，气道炎症和AHR存在分离现象，即两者并不一定并行存在，因此推测AHR可能独立气道炎症或气道炎症发生之前即可存在。
气道平滑肌收缩的两个基本特征是产生收缩力的能力和气道收缩的速率，而后者取决于平滑肌收缩时所遇到的阻力负荷。因此，我们在进行肌动描记操作之前，首先以高钾溶液获得气管平滑肌最大长度，在最大长度的基础上检测平滑肌收缩反应即收缩张力。气道平滑肌收缩的另一个特点是它可因激动剂浓度梯度的增加而逐渐产生兴奋、收缩，直到一个顶点即所有的受体均被该激动剂结合。这样就产生一个剂量(Log对数)一反应的S形曲线，这个曲线的特征包括位置(灵敏性)、斜率(反应性)、平台(最大反应值)。
本实验采用肌动描记技术和Ach梯度滴定，检测离体支气管的收缩反应、收缩张力。首先，我们检测支气管的收缩反应是否具有可重复性，我们的结果与Liu等的报道类似，即Ach诱导的离体支气管收缩反应具有很好的可重复性，从而便于我们进行后续的实验研究，其次通过对空气组和OVA暴露组小鼠在Ach诱导支气管收缩反应比较发现，OVA暴露小鼠可加重平滑肌收缩反应。
p38MAPK受到环境应激、细胞因子(TNF-a、IL-1β)、内毒素、香烟烟雾、生长因子和共刺激分子等作用时，既可活化TNF-a，参与细胞分化、生长、凋亡、移行。p38MAPK抑制剂SB203580(而非ERK抑制剂PD98059)可抑制平滑肌收缩。Kwon和Lee等的研究证实，p38MAPK／HSP27(而非ERK)参与ET-1介导的自发性高血压大鼠的主动脉收缩。最近，Ihara等的研究总结了p38MAPK途径通过数种方式调节胃肠平滑肌收缩：①p38MAPK／HSP27可逆转钙调蛋白结合蛋白对肌球蛋白Ⅱ的Mg-ATP酶抑制效应；②p38MAPK通过磷酸化肌球蛋白磷酸酶靶亚基1而抑制MLCP活性，引发肌肉收缩。由于我们前期对于大鼠的研究提示虫草素可能更多地依赖抑制MAPK家族的成员之一的p38MAPK信号通路中起效，因此本次对于小鼠气道收缩的研究聚焦p38MAPK在虫草素和(或)糖皮质激素介导的气道收缩中的作用。我们的研究结果显示分离的小鼠支管对Ach的最大等长收缩力受到p38MAPK抑制剂的抑制，表明p38MAPK参与支气管平滑肌最大等长收缩反应。
激素是在慢性哮喘中最常应用也是迄今为止最为有效的抗炎药物，其通过与相关基因启动子或增强子的激素反应元件相互作用，经转录活化诱导抗炎基因的表达，或直接与转录因子如NF-кB、APLl等结合，经转录抑制而下调炎性基因的表达。激素对激动剂引起的平滑肌收缩具有抑制效应。Sun等报道，布地奈德可在15 min内减少豚鼠的气道平滑肌等长张力收缩。目前有关激素作用机制的研究多聚焦于抗炎作用，而其抑制气道平滑肌收缩效应的研究报道较少。研究激素与气道平滑肌的直接作用，有助于理解激素的作用机制。在本实验中，激素孵育1 h即可抑制气道平滑肌收缩力。因此我们推测，激素也有可能通过非基因组机制发挥作用。
Linden研究发现胞外腺苷聚集是炎症反应初始阶段限制细胞损伤的机体防御性反应，是保护性的自分泌和旁分泌的信号传导机制。腺苷和其他内源性物质在炎症反应中适度激活抑制性信号传导系统．其重要性在多种炎症疾病中都已被证明(如败血症、类风湿一睢关节炎、动脉粥样硬化和肿瘤等)。体外实验证明腺苷能抑制中性粒细胞功能(如抑制其产生氧自由基、黏附血管内皮、损伤内皮细胞、吞噬作用等)，亦能抑制巨噬细胞产生炎性细胞因子，还能下调内皮细胞的活化(包括抑制细胞因子的释放和黏附分子的表达)。腺苷在炎症反应中的调节作用足通过AR介导，在前期结果发现虫草素可能基于激活A2aAR而发挥潜在的抗炎作用，但在本实验中，我们发现单独应用虫草素对于气道平滑肌收缩力产生一定的收缩抑制作用，但仅在OVA组产生统计学意义，是否由于在OVA刺激下激活一定量A2aAR受体后方参与气道平滑肌收缩力的抑制作用则需进一步研究，然而Dex联合虫草素治疗则仍表现出一定的抑制气道平滑肌收缩作用，而且效果似乎优于Dex单独干预组，而对于p38MAPK/HSP27信号通路的抑制作用较激素单独应用组有增大趋势，但无统计学意义，因此两者的协同作用有待于进一步研究。同时我们发现在哮喘模型的小鼠支气管，与对照组相比较不论虫草素单独及和激素联合应用都具有更强的抑制p38MAPK/HSP27磷酸化的作用，提示虫草素可能对活化而非生理性的p38MAPK信号通路产生作用。
总之，我们的研究表明Ach诱导的离体支气管收缩反应具有良好的可重复性，OVA吸人可 导致Ach诱导的支气管收缩作用加重。p38MAPK信号通路参与Ach诱导的气道平滑肌收缩反应，激素可有效抑制Ach诱导的气道平滑肌收缩，而联合虫草素治疗可使上述平滑肌收缩抑制能力进一步加强，激素联合虫草治疗可能通过抑制p38MAPK/HSP27磷酸化水平发挥上述作用。
（摘自：《国际呼吸杂志》2012年第32卷第20期：1545-1551）
